如何科學(xué)正確地使用凍存管呢？

　　凍存管的使用是一門學(xué)問，并不是打開液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的。科學(xué)正確地使用凍存管，可以避免樣本的損失，并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。

　　凍存管有IATA航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試證書，常規(guī)儲(chǔ)存細(xì)胞培養(yǎng)物，組織樣品，微生物樣品(如病毒，細(xì)菌，酵母，真菌，孢子等)，人源或動(dòng)物源其它生物樣品(如血液，血清，精液，抗體，RNA, DNA和蛋白樣本)，不適合存儲(chǔ)再生醫(yī)學(xué)樣本。

　　冷凍步驟:

　　用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細(xì)胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細(xì)胞系確定)。

　　37℃孵育細(xì)胞3-5分鐘。

　　細(xì)胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細(xì)胞。

　　離心細(xì)胞懸液(500 x g, 5分鐘)，用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

　　細(xì)胞計(jì)數(shù)。

　　離心細(xì)胞懸液(500 x g, 5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。

　　以1:1體積比混合細(xì)胞和凍存液(60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，20% DMSO)，然后轉(zhuǎn)移到凍存管中。凍存的細(xì)胞密度為 1-5×106 個(gè)/毫升。

　　含有細(xì)胞的凍存管建議以−1 K / min 的速率降溫，可以將凍存管置于−70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲(chǔ)其他樣品，可以直接放置在−20℃，−70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4 mL和5 mL的凍存管需要先置于在−20℃冰箱過夜，然后再轉(zhuǎn)移到−70℃或者液氮的氣相。

　　然后轉(zhuǎn)移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請(qǐng)將凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。

　　解凍步驟:

　　從液氮罐取出凍存的細(xì)胞后立即置于37℃水浴搖晃Cryo.sTM凍存管1-2分鐘。解凍過程需要越快越好。

　　轉(zhuǎn)移解凍的細(xì)胞于15 mL離心管，立即用大量的含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基混勻。

　　500 x g離心細(xì)胞5 分鐘，去除上清液，用適量的含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

　　按照建議的細(xì)胞濃度接種。

　　接下來(lái)的12小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入靜默期。

　　間隔24小時(shí)和48小時(shí)更換培養(yǎng)基

　　如果細(xì)胞感染了病毒，也可以參考以上步驟進(jìn)行冷凍存儲(chǔ)和解凍的操作。

　　凍存管安全操作建議

　　凍存管用來(lái)存儲(chǔ)樣品，只能置于液氮?dú)庀嗷虮?。禁止凍存管浸沒于液氮液相，否則液氮可能滲入凍存管。因此，解凍時(shí)，蒸發(fā)的液氮產(chǎn)生高壓力，終導(dǎo)致凍存管炸裂，并且還將導(dǎo)致感染物質(zhì)釋放。

　　因此，操作凍存管時(shí)需要佩戴合適的個(gè)人安全防護(hù)措施，如穿戴安全護(hù)服、佩戴護(hù)目鏡、在安全櫥操作。

　　進(jìn)行冷凍保存時(shí)，凍存管需要緩慢地降溫至冷凍溫度。如果不是緩慢地降溫到冷凍溫度，將導(dǎo)致冰塞形成(如在凍存管頂部)，冰塞將阻礙液體形成凝固，將導(dǎo)致高壓力危險(xiǎn)和后續(xù)的爆管風(fēng)險(xiǎn)。