天津本生—PCR技術原理、實驗步驟和應用

　　實驗目的

　　1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

　　2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術。

　　二、實驗原理

　　PCR技術，即聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學獎)建立的。這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA的片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術在分子生物學研究中具有*的意義，大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

　　PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA的片段。細胞中DNA的復制是個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

　　PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備;

　　②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

　　重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　三、實驗試劑與器材

　　模板DNA、2.5mmol/LdNTP

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O

　　PCR儀、移液槍、PCR板

　　四、實驗步驟

　　1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA2μL

　　引物11μL

　　引物21μL

　　dNTP1.5μL

　　MgCl22μL

　　10×buffer2μL

　　ddH2O10μL

　　Taq酶0.5μL

　　2、設置PCR反應程序。

　　3、上樣，啟動反應程序。

　　4、擴增產物的電泳檢測。

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