本生分享實驗技巧：ELISA各個操作步驟的注意要點

　　ELISA實驗每個步驟的注意要點，直接關系到實驗結果的準確性，本生BUNSEN小編分步驟整理如下：

　　一、實驗前準備

　　所有試劑提前從冷藏環境取出，?平衡至室溫(20-25℃)?再使用，避免低溫影響抗原抗體結合效率;未開封試劑需在2-8℃避光保存，標準品建議分裝凍存，避免反復凍融降解。本生BUNSEN試劑盒

　　實驗前檢查移液器校準情況，多通道移液器需逐孔校準移液體積，避免移液誤差導致結果偏差。

　　提前確認洗滌液濃度是否正確，若出現結晶需充分溶解混勻后再使用。

　　二、包被步驟

　　包被抗原/抗體需用?碳酸鹽緩沖液(pH9.6)?稀釋，濃度需通過預實驗確定，濃度過高會增加非特異性背景，過低會導致信號不足。

　　包被時保證每孔加液均勻，避免觸碰孔底刮傷包被面;包被后建議4℃?靜置過夜(12-16小時)?，比37℃孵育結合更穩定，背景更低。

　　包被完成后立即吸干孔內液體，立刻加入封閉液，避免孔底干燥導致封閉不均。

　　三、封閉步驟

　　封閉液選擇需匹配實驗體系：一般檢測用5%脫脂奶粉，磷酸化蛋白檢測推薦用1% BSA(脫脂奶粉含磷酸化酶會干擾結果)。

　　封閉時間至少1-2小時，推薦室溫封閉，避免4℃封閉時間過長導致包被物脫落;封閉后充分洗滌3次，去除未結合的封閉蛋白。

　　四、加樣步驟

　　加樣時槍頭不要觸碰孔壁和孔底，避免戳掉包被物;每加完一個樣本更換一次槍頭，避免交叉污染。

　　加樣速度保持均勻，避免液體濺出或產生氣泡，若出現氣泡可輕輕用槍頭戳破，避免氣泡影響后續讀數。

　　樣本加樣后輕輕震動酶標板，確保樣本均勻覆蓋孔底，避免局部結合不均勻。

　　五、孵育步驟

　　孵育必須在?濕潤環境?中進行，可在孵育盒底部墊濕潤濾紙，避免孔內液體蒸發導致濃度偏差。

　　嚴格按照說明書控制孵育時間，不要隨意延長，延長會增加非特異性結合導致背景升高。

　　37℃孵育需密封孵育盒，避免冷凝水滴入孔內，導致樣本濃度被稀釋。

　　六、洗滌步驟

　　洗滌是降低背景的核心步驟，每次洗滌需注滿每孔，浸泡30秒后再吸干，重復洗滌至少3-5次。

　　每次洗滌完成后，將酶標板倒置在干凈吸水紙上用力拍干，去除孔內殘留未結合物。

　　全自動洗板機使用后需定期清理管道，避免殘留鹽分堵塞管道，導致洗滌不充分。

　　七、顯色步驟

　　底物溶液需現配現用，避光保存，避免提前氧化失效;加入底物時避免光照，顯色過程建議避光孵育。

　　顯色時間需通過預實驗控制，不要過度顯色，當陽性對照出現明顯顏色即可終止，過度顯色會升高背景。

　　加入底物后觀察顯色均勻性，如果出現不顯色斑塊，多是洗滌時刮傷包被面導致，實驗結果需作廢。

　　八、終止與讀數

　　終止液加入順序和速度盡量和底物保持一致，確保每個孔終止反應時間一致;終止后15分鐘內必須完成讀數，超過時間產物會褪色，導致OD值偏低。

　　讀數前需擦干凈酶標板底部，去除指紋、水漬，避免干擾透光率導致讀數誤差;設置雙波長讀數(測量波長+參比波長)，可有效降低背景噪音。

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